دانشگاه آزاد اسلامی

واحد شاهرود

دانشکده فنی و مهندسی – گروه مهندسی شیمی

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc.))

گرایش:صنایع غذایی

عنوان:

بررسی آنزیم شفاف ساز آب میوه و ارائه مدل سینتیکی برای آن

استاد راهنما:

دکتر حسن زارع علی آبادی

استاد مشاور:

دکتر علی اصغر روحانی

چکیده :

 پکتینازها گروهی از آنزیم های هیدرولیتیک هستند که مواد پکتیکی را تجزیه می کنند. اگزوپلی گالاکتوروناز(exo-p) و اندوپلی گالاکتوروناز(endo-p) دو نوع از این گروه هستند. در این پژوهش ابتدا دو گونه قارچی به نامهای آسپرژیلوس نایجر و وتریکودرماریسی که قادر به تولید پکتیناز بوده جداسازی شدند. نتایج حاصل از مقایسه دو گونه نشان داد که گونه قارچی آسپرژیلوس نایجر توانایی بالاتری برای تولید پلی گالاکتورونازها در مقایسه با گونه تریکودرماریسی دارد. بهینه سازی بعضی از عوامل موثر در تولید پلی گالاکتورونازها توسط آسپرژیلوس نایجر تحت شرایط کشت سطحی ناپیوسته نشان داد که در غلظت g/L50 پکتین به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بیشترین مقدار تولید بدست می آید. در این حالت نسبت بهینه سولفات آمونیوم به پکتین 3/0 و زمان بهینه تخمیر 4روز بود.

امکان تولید مداوم پلی گالاکتورونازها به روش تخمیر کشت سطحی نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که تولید مداوم پلی گالاکتورونازها به روش تخمیر کشت سطحی امکانپذیر است. زمانی که غلظت پکتین در خوراک g/L50 و زمان ماند 1 روز بود بالاترین فعالیت اگزوپلی گالاکتوروناز U/mL5/1در جریان خروجی بدست آمد و تحت همین شرایط فعالیت اندوپلی گالاکتوروناز حدود U/mL015/0بود. استفاده از جریان برگشتی با نسبت 8/0 باعث افزایش غلظت اگزو و اندوپلی گالاکتوروناز به ترتیب تا 8/1 و 016/0 گردید. فرایند تولید پلی گالاکتورونازها در رآکتور کشت سطحی مدلسازی شد. برای اینکار از یک معادله سینتیکی میکائیلیس- منتون استفاده شد. پارامترهای رابطه سینتیکی با استفاده از یک سری داده های تجربی بدست آمد. مدل ارائه شده، داده های تجربی دیگر را با دقت قابل قبولی پیش بینی می کند.

جایگزینی پکتین با تفاله چغندر قند نیز در روش کشت سطحی مورد بررسی قرار گرفت که تفاله

چغندر قند بدلیل نامحلول بودن و ته نشینی نتایج خیلی ضعیفی در مقایسه با پکتین داد، اما استفاده از تفاله چغندر قند در روش تخمیر حالت جامد باعث تولید پلی گالاکتورونازها در مقادیری قابل مقایسه با مقادیر تولید شده در تخمیر پکتین باروش کشت سطحی شد(U/g5/5 برای اگزو و U/g06/ 0 برای اندوپلی گالاکتوروناز). سپس تولید پلی گالاکتورونازها از تفاله چغندر قند به عنوان سوبسترا بوسیله قارچ آسپرژیلوس نایجر (A.niger) در تخمیر حالت جامد (SSF) به صورت شبه مداوم با استفاده از چکاندن قطره ای محلول معدنی پایه بر روی تفاله انجام گرفت. در این سیستم فرایند به مدت 25 روز ادامه داشت و تولید کلی پکتیناز در این سیستم بسیار بالاتر از سیستم ناپیوسته بود یعنی تولید تجمعی آنزیم دراین 25 روز U/g24/69 برای اگزوپلی گالاکتوروناز و U/g738/0 برای اندوپلی گالاکتوروناز بدست آمد که نتایج بسیار مطلوبی بود.

مقدمه

در حال حاضر جمعیت جهان بالغ بر پنج میلیارد نفر می باشد. از روشهای مختلفی باید مواد غذایی مورد نیاز آنها را تامین کرد. با پیشرفت میکروب شناسی کاربردی استفاده از میکروارگانیسم ها و آنزیم های حاصل از آنها و سایر متابولیت های میکروبی، به عنوان روشهایی در تولید مواد غذایی و بهبود کیفیت و کمیت آنها، در تولید مواد غذایی راه یافته اند. بنابراین با کنترل و فرآیند کردن روش های نسبی و به کار گرفتن میکروارگانیسم های شناخته شده و مناسب، می توان کیفیت و کمیت انواع مواد غذایی را بطور قابل ملاحظه ای افزایش داد. از آن جمله می توان به استفاده از آنزیم های میکروبی به مانند پکتیناز ، سلولاز ، آمیلاز و پروتئاز برای شفاف کردن آب میوه و حذف پکتین و الیاف سلولز در آن استفاده کرد. پکتیناز در سال 1930 بوسیله آزمایش های زیادی که در فرآیند تولید آب میوه و شراب انجام شد، کشف گردید. در طول سال 1960 اطلاعات وسیعی از شیمی گیاهان بدست آمد که کاربرد موثر آنزیم ها را نشان می داد، که از آن جمله آنزیم پکتیناز بود .آب میوه، مایع استخراج شده از سلول های میوه های رسیده میباشد. در هر نوع میوه رسیده سه نوع قند مختلف، بنام های فروکتوز، گلوکز و ساکارز وجود دارد. همچنین در انواع میوه ها، اسیدهای آلی مختلف، از جمله اسید سیتریک، اسید مالیک و اسید تارتاریک به همراه انواع ویتامین ها و مواد معدنی وجود دارند. این ترکیبات در میوه ها به آنها خصوصیات شیرینی وترشی را می دهند. آب میوه هایی که با کیفیت پایین و رنگ تیره، در بازار عرضه می شوند، اگر چه از عمر طولانی و قیمت پایین برخوردارند، با این وجود مورد پسند مشتریان واقع نمی شوند. بنابراین تولید کنندگان آب میوه، باید به کیفیت آب میوه توجه داشته باشند. یکی از مراحل مهم در فرآیند تولید آب میوه ها، بخصوص آب میوه سیب مرحله آنزیم زنی است. مرحله آنزیم زنی از اهمیت خاصی برخورداراست، چون با حذف این مرحله در فرآیند، باعث تولید آب میوه کدر خواهد شد.

امروزه در اکثر نقاط دنیا، آب میوه بصورت شفاف شده تهیه و تولید می شود. آنزیم ها، در واقع، کاتالیزورهای زیستی با ماهیت پروتئینی هستند و توسط موجودات زنده حیوان، گیاه و میکروارگانیسم تولید می شوند. انجام تمامی واکنش ها در سلول زنده به آنزیم نیازمند است. نقش عمده آنزیم ها در موجودات زنده، کاتالیزور واکنش های تجزیه و ترکیب است. آنزیم ها موجب افزایش سرعت واکنش های زیستی می شوند و در معرض تغییرات فیزیکی و شیمیایی قرار می گیرند.

فعالیت کاتالیزوری آنزیم ها معلول ساختمان خاص پروتئینی آنها است و عمل کاتالیزوری آنها در جای مشخصی از آنزیم به نام جایگاه فعال یا جایگاه کاتالیزوری انجام می شود.

همان طور که اشاره شد، آنزیم ها را می توان از منابع مختلف حیوانی، گیاهی و میکروبی تهیه کرد. آنزیم های تجارتی در سه گروه زیر طبقه بندی می شوند:

1- آنزیمهای صنعتی، مانند آمیلازها، پروتئازها، گلوکز ایزومراز، لیپاز، کاتالاز، پنیسیلین آمیلاز و آنزیم های پکتیکی

2- آنزیمها آنالیتیکی، مانند گلوکز اکسیداز، گالاکتوز اکسیداز، الکل دهیدروژناز، هگزوکیناز،مورامیداز و کلسترول اکسیداز

3- آنزیم های پزشکی، مانند آسپراژیناز، پروتئاز، لیپاز و استرپتوکیناز

آنزیم ها از دیدگاه انواع واکنش هایی که توسط آنها کاتالیز می شوند، به 6 دسته تقسیم شده اند:

دسته اول، گروه اکسیدوردوکتازها: این آنزیم ها کاتالیزور واکنش های اکسایشی- کاهشی هستند و عبارتند از دهیدروژنازها، اکسیدازها و پروکسیدازها

دسته دوم، گروه ترانسفرازها: این آنزیم ها در واکنش هایی که در آنها گروههای شیمیایی انتقال می یابد، به عنوان کاتالیزور عمل می کنند. در این گروه می توان از کینازها که گروه فسفات را از ATP به جسم دیگر منتقل می سازند و ترانس امینازها که انتقال گروه آمینی را به عهده دارند، نام برد.

دسته سوم،گروه هیدرولازها: این آنزیم ها کاتالیزورهای واکنش های آبکافت هستند و عبارتند از: آنزیم های پکتیکی، لیپازها و آمیلازها.

دسته چهارم، گروه لیازها: این آنزیم ها گروههای بخصوصی را بدون انجام عمل آبکافت حذف می کنند و تشکیل پیوند دوگانه می دهند. از این گروه می توان دکربوکسیلازها و آلدولازها را ذکر کرد.

دسته پنجم، ایزومرازها: این آنزیم ها، کاتالیزور واکنش جابجایی داخلی بر روی یک ماده اولیه هستند. از این گروه می توان ایزومرهای سیس- ترانس، اپی مرازها و راسمازها را ذکر کرد.

در این واکنش ها ATP به عنوان دهنده انرژی توسط لیگازها آبکافت، وAMP و پیرو فسفات ایجاد خواهد شد.

پکتینازها (Pectinase) آنزیمهایی هستند که معمولاّ با روش میکروبی، بعنوان یک محصول برون سلولی توسط میکروارگانیسم های مولد آن تولید می شوند.

عموماانزیم پکتیناز به سه روش تخمیر غوطه ور[1] ، تخمیر حالت جامد[2] و کشت سطحی[3] تولید می گردد. تخمیر حالت جامد به علت مزایای زیادی که در مقایسه با دو روش دیگر دارد مورد توجه محققان می باشد. کشت سطحی نیز دارای مزایایی است که خود را از دو روش دیگر متمایز می سازد. مهم ترین مزایای این روش عبارتند از: کم بودن هزینه و انرژی مورد نیاز، در پایان تخمیر می توان مایع زیر توده میکروبی را کشیده و با محیط کشت جدید جایگزین نمود، به این ترتیب با حفظ قارچها از سیکل قبلی دوره متوسط تخمیر در سیکل جدید کاهش می یابد، نیاز به هوادهی داخل محیط کشت و هم زدن ندارد.

مطالعات بسیاری به تولید پکتیناز به روش تخمیر غوطه ور یا حالت جامد یا کشت سطحی با استفاده از قارچ آسپرژیلوس نایجر اختصاص داده شده است. مهمترین مزیت استفاده از قارچ آسپرژیلوس نایجر کاربرد آسان آن و قابلیت تخمیر طیف گسترده ای از مواد خام ارزان قیمت و راندمان بالای تولید می باشد.

فصل اول این پایان نامه به مبانی و کلیات نظری و مرور پژوهش های گذشته اختصاص دارد. در فصل دوم روش های استخراج و تخلیص آنزیم آورده شده است. در فصل سوم مواد و روش های اندازه گیری به کار برده شده در این تحقیق توضیح داده شده است. در فصل چهارم نتایج ارائه و تحلیل شده است. در فصل پنجم مدلی برای تولید مداوم پلی گالاکتورونازها آورده شده و در فصل ششم نتیجه گیری نهایی و پیشنهاداتی برای ادامه پژوهش ارائه گردیده است.

1-1- پکتینازها

پکتینازها[4] گروه بزرگی از آنزیم ها هستند که پلی ساکاریدهای گیاهی را به مولکولهای ساده تر مثل گالاکتورونیک اسید می شکنند.این عمل موجب افزایش بازده و شفاف سازی آب میوه جات می شود. از آنجه که مواد پکتیکی گروهای مولکولی پیچیده ای هستند آنزیمهای پکتینو لیتیکی مختلفی نیاز است تا بتوانند آنها را به صورت کامل بشکنند. تولید پکتیناز 10% از کل تولید آنزیم ها را به خود اختصاص داده است.آنزیم های پکتینولیتیکی به صورت گسترده در صنایع غذایی برای تولید آبمیوه و دیگر نوشیدنیها استفاده می شوند. این بخش آنزیم پکتینولیتیکی و سوبستراهای آنها، تولید میکروبی پکتیناز و عوامل مؤثر بر آن و همچنین کاربردهای صنعتی این آنزیم ها را شرح می دهد.

1-2- سوبسترای پکتیکی

سوبستراهای پکتیکی مولکولهای گلوکوزیدی پیچیده با جرم مولکولی بالا هستند که در کشت ها پیدا میشوند. آنها در دیواره ابتدایی سلولی حضور دارند و اجزاء اصلی لامای میانی هستند، یک لایۀ چسبنده بین دیواره ها و سلولهای جوان نزدیک تشکیل می دهند.در مدت کوتاهی، آنها باعث شکل گیری ساختار و پیوستگی بافت های گیاه می شوند. سه گروه اصلی پلی ساکاریدهای پکتیکی ساخته شده اند که همگی دارای دی- گالاکتورونیک اسید هستند.

1-2-1- هوموگالاکتورونان(HG)

یک پلیمر خطی است که به وسیلۀ دی- گالاکتورونیک اسید که می تواند استیله یا متیل استری شده باشد،

تشکیل می شود. این قسمت می تواند قسمت صاف پکتین نام بگیرد. مولکول بر حسب سطح استری شدن آن دسته بندی می شود: پکتینی که حداقل 75% گروههای کربوکسیل آن متیله شده باشند؛ اسپکتینی که کمتر از 75% گروه کربوکسیل متیله دارد؛ اسید پکتیک یا پلی گالاکتورونیک اسید که گروه کربوکسیلی متیل استری شده ندارد. کلمه پکتین معمولاً برای تمام مواد پکتیکی به کار برده می شود.

1-2-2- رامنو گالاکتورونان (RGI)

RGI از تکرار دی ساکاریدرامنوز گالاکتورونیک اسید بوجود آمده است. باقیمانده های گالاکتورونی میتوانند استیله شده و هر دو گروه باقیمانده می توانند زنجیره های جانبی قند را به مثل گالاکتوز، آرابینوزو زایلوز جدا کنند.

1-2-3- رامنو گالاکتورونان (RGΠ)

بر خلاف اسم آن RGΠیک زنجیرۀ هوموگالاکتورونان است. که دارای زنجیره های جانبی پیچیده که به باقیمانده های گالاکتورونیک متصل هستند، می باشد.

ویکن و همکاران یک ساختار برای پکتین پیشنهاد دادند که در این مدل HG و RGII زنجیره های جانبی طویل برای RGI می باشند. شکل(1-1) هر دو زنجیرۀ RG منطقه کرکی مولکول نامیده می شوند. در میوجات نارس، پکتین به صورت ماده پکتیکی نامحلول در آب یعنی پرتوپکتین یافت می شود. پکتین با فیبرهای سلولز پیوند برقرار می کند و به صورت صلب روی دیوارۀ سلول در می آید. در هنگام رسیدن میوه ساختار پکتین را با شکاندن زنجیرۀ اصلی یا زنجیره های فرعی دگرگون می کنند که نتیجۀ آن ایجاد مولکولهای قابل حل بیشتر می باشد. مواد پکتیکی تمایل به تشکیل ساختار ژل مانند دارند این تمایل هنگامی روی می دهد که بخش های HG تشکیل یک شبکه کریستالی سه بعدی داده باشند که آب و مواد محلول در فواصل شبکه جایگزین شوند. فاکتورهای متعددی مانند دما، نوع پکتین، درجۀ استری شدن، درجه استالی شدن، pH، قند و دیگر حل شونده ها و خصوصاً تداخل بین یونهای کلسیم و گروههای کربوکسیل استری نشده پکتین خصوصیات ژلی پکتین را تعیین می کنند. در پکتین با درجه استری شدن بالا، مناطق اتصال بوسیلۀ اتصال جانبی HG توسط پیوند هیدروژنی و نیروهای هایدروفوبیک بین گروههای متوکسی که هر دو توسط غلظت بالای قند و pH پایین تقویت می شوند تشکیل می شوند.

1-3- آنزیم های پکتینولیتیکی

پکتینازها گروهی از آنزیم ها هستند که شکستن مواد پکتیکی را هنگام واکنش های شکستن پلیمرآنها (هیدرولیز) یا دی استری شدن کاتالیز می کنند.

شکل 1-1 : ساختار پایه ای پکتین شمای کلی ساختار معمولی (A) و ساختار جایگزین پیشنهادی(B)

شناخته شده ترین آنزیم های پکتینولیتیکی آنزیم های شکنندۀ هوموگالاکتورونان هستند. شکل(1-3) شکل عمل آنزیم پکتیناز را نشان می دهد.

1-3-1- پرتو پکتینازها

پرتو پکتینازها پکتین نامحلول را به صورت پلیمر قابل حل در می آورند آنها به دو دسته تقسیم میشوند: یکی آنهایی که با منطقۀ پلی گالاکتورونیک اسید از پرتو پکتین واکنش می دهند که نوع A نامیده می شود و دیگری آنهایی که با زنجیرۀ پلی ساکارید که زنجیرۀ پلی گالاکتورونیک اسید را به دیوارۀ سلول متصل می کند، واکنش می دهنداین گروه نوع B نامیده می شوند.

1-3-2- پکتین متیل استراز(PME)

پکتین متیل استراز ، دی استری شدن گروه متوکسی پکتین را که اسید پکتیک و متانول تولید می کند، کاتالیز می کند. این آنزیم به صورت گزینشی روی گروه متیل استری واحد گالاکتورنات تا یک گروه غیر استری واحد گالاکتورونات عمل می کند.این آنزیم قبل از پلی گالاکتوروناز و پکتات لیاز عمل می کند و نیاز به سوبسترای غیر استری دارد . این آنزیم در گروه کربوهیدارات استراز طبقه بندی می شود.

1-3-3- پکتین استیل استراز

پکتین استیل استراز، استیل استر پکتین که تولید کتیک اسید و استات می کند را هیدرولیز می کند. این آنزیم در گروه خانوادۀ 12و 13 کربوهیدرات استراز طبقه بندی می شود.

1-3-4- پلی متیل گالاکتوروناز(PMG)

پلی متیل گالاکتوروناز شکستن هیدرولیتیکی پیوند آلفا1- و4 گلوکوزیدی را زنجیرۀ اصلی پکتین کاتالیز میکند. این عمی خصوصاً بر روی پکتین L درجۀ استری بالا صورت گرفته و تولید 6- متیل گالاکتورونات می کند.

برای دانلود متن کامل پایان نامه اینجا کلیک کنید.